第一幕，圣安德烈亚·瓦勒教堂。在警察总督史卡比亚的主题旋律下，揭开序幕。衣衫褴褛、面容憔悴的越狱政治犯安杰洛提逃到教堂里，他的妹妹已经安排好一把钥匙，让安杰洛提可以暂时躲进教堂内的小礼拜堂，避避风险。这时，一位教堂司事走了进来，他不停抱怨工作太繁重，直到画家卡伐拉多西进来之后，他才停止继续发牢骚。卡伐拉多西在教堂一侧搭了一个画台，画架上是一幅尚未完成的仕女图。卡伐拉多西看着画像中金发碧眼的女士，忍不住发出赞叹，但心里面却想着自己的爱人托斯卡：“在各种美的事物中，有一种奇妙的调和。我亲爱的托斯卡有一头乌黑亮丽的头发、还有一对闪亮的黑眼，而画里面这位不知名的女士却是金发碧眼。我虽身在画前，心里所思所想都只有托斯卡！”在教堂执事离开后，卡伐拉多西正要提笔做画，却听到身后有声响，回头一看，从小礼拜堂走出一位步履蹒跚、狼狈不堪的男子，卡伐拉多西仔细打量对方之后，才认出眼前这位竟然是他的好友、也就是前罗马共和国的领事安杰洛提。适巧托斯卡前来教堂寻找卡伐拉多西，见大门反锁，于是在门外大声呼喊，卡伐拉多西见状赶紧教安杰洛提再躲进小礼拜堂内，因为他不想让托斯卡知道太多事(托斯卡人虽善良，但有时就是嫉妒和猜疑心重，而且还守不住秘密)。在打点好安杰洛提之后，卡伐拉多西才前去应门；托斯卡怒气冲冲地走进来，并质问卡伐拉多西是不是在跟其它的女人幽会？在卡伐拉多西好言相劝之下，托斯卡才稍微释怀，并邀约卡伐拉多西共度良宵。卡伐拉多西以手边尚有工作为由，暂请托斯卡离去，而托斯卡离开前，却瞄见卡伐拉多西正在赶工的画作，上面竟是一位金发蓝眼的美女，于是又大发醋劲。卡伐拉多西安慰着说，这世上还有哪对眼珠可以和托斯卡的黑眸相比呢？但托斯卡还是不放心地再三交待，要卡伐拉多西把画上女子的眼珠改为黑色，才行离去。托斯卡走后，卡伐拉多西暗示安杰洛提走出小礼拜堂，准备带他到乡间别墅避风头。之后，教堂司事和教士以及唱诗班团员一拥而进，他们正为原本要入侵意大利的拿破仑法军被击退而欢喜不已。此时，警察总督斯卡比亚率领一群警察前来教堂搜索安杰洛提踪迹，在查问之下，他确定安杰洛提是在卡伐拉多西的协助之下展开逃亡。在这当儿，托斯卡忽然回到教堂中寻找卡伐拉多西。斯卡比亚原本就对托斯卡十分爱慕，但却始终不得美人芳心，此时他见机不可失，于是利用一把在教堂中找到的女用折扇，挑拨起托斯卡的猜疑和嫉妒心，想藉此透过托斯卡找到卡伐拉多西。托斯卡被斯卡比亚一番话激怒之后，决心不放过背叛爱情的男友，斯卡比亚见托斯卡中了嫉妒毒药，想上前安慰，却被托斯卡拒绝。斯卡比亚随后安排人员跟监伤心欲绝的托斯卡的行踪，另一方面他对自己的一石二鸟之计逐渐产生效用，暗自窃喜，在教堂的感恩弥撒歌声中，他不禁得意高呼：“托斯卡，你让我忘记了上帝的存在！”