第一幕：越狱逃脱的政治犯安吉罗提（Cesare Angelotti，男低音）冲进圣安德烈第拉瓦雷教堂（Church of Sant' Andrea della Valle）内的阿塔凡蒂侯爵家的礼拜堂，他刚刚躲好，一个老教堂执事蹒跚的走进来，祈祷的钟声响起。不久，在教堂内画壁画的画家卡瓦拉多希（Mario Cavaradossi，男高音）进来，他掀开画布，继续画以安吉罗提的姐姐、侯爵夫人玛格达莱娜为形象的玛利亚（Mary Magdalene）。卡瓦拉多希从怀中拿出自己的情人女歌手托斯卡（Floria Tosca，女高音）的小肖像来跟画像比较，一个是黑色的眼珠，一个则金发碧眼，却同样的美丽（Recondita Armonia，奇妙的调和，此旋律后来变成了侯爵夫人玛格达莱娜的动机）。一旁的教堂执事抱怨着离开。安吉罗提从礼拜堂中露出了脸，他很高兴能够和以前的同志卡瓦拉多希再次见面，卡瓦拉多希激动的拿食物给他，当听到托斯卡的声音，安吉罗提赶紧又藏起来。托斯卡是一个忌妒心很强的女人，她总是疑心卡瓦拉多希背着她跟别的女人来往，看到画中蓝色眼睛的侯爵夫人她更有了怀疑的理由（Mario!Mario!Mario!），卡瓦拉多希微笑着向她解释让她平静下来（Qual`occhio al Mondo），并说定晚上音乐会后在他郊外的小屋再见。托斯卡走后卡瓦拉多希招呼安吉罗提出来，告诉他自己小屋的去路，并说如遇危险可以躲在花园的古井中。外面响起了通知有人越狱的炮声，两个人立刻离开教堂。同时，教堂执事带着唱诗班的孩子们进来，他们喧闹着，因为有人说罗马军队已把拿破仑（Napoleon）赶出了意大利。当前来搜寻安吉罗提的秘密警察局长斯卡皮亚男爵（Baron Scarpia，男中音）出现时，大家都安静下来，他在侯爵家的礼拜堂里发现了侯爵夫人的扇子以及吃完食物的空盒子（此时奇妙的和谐之旋律再度出现），而墙壁上的玛利亚画像则告诉了他画这幅像的人就是卡瓦拉多希。托斯卡由于不放心又回来找卡瓦拉多希，但却遇到曾经垂涎于她的斯卡皮亚，她的脸上露出厌恶的表情，但心怀诡计的警察局长热情迎上前向她问好。斯卡皮亚把自己刚刚找到的侯爵夫人的扇子拿给托斯卡看，并极力的添油加醋，认为卡瓦拉多希背叛自己的托斯卡流着眼泪发誓要报复。托斯卡离开，教堂里渐渐人多起来，人们来做祷告。斯卡皮亚派人跟踪托斯卡，看着落入他圈套的女人，斯卡皮亚笑起来，那声音令人毛骨悚然（Va，Tosca!）